顯微鏡動畫科普 如何用"導數"看見透明世界？——微分干涉差（DIC）顯微鏡光路解析與成像仿真

本期視頻將通過動畫,仿真與實操 來帶大家瞭解微分干涉差顯微鏡的成像機制 極致的分辨率 優秀的對比度 這就是微分干涉差顯微鏡的代名詞 對於傳統明場光學顯微鏡 經常會因為標本透明度過高而喪失對比度 染色可能會破壞樣本活性 而DIC無需處理標本 即可擁有超高的分辨率與對比度 這是一臺擁有DIC系統的光學顯微鏡 它的主要結構是 霧鏡、聚光鏡、起偏、DIC下棱鏡、DIC上棱鏡、減偏 在偏振系統下 光源發出的光被DIC下棱鏡剪切成兩束成微小角度分離的光 隨後經過聚光鏡 變為兩束間距極小且平行的光 以略微錯開的方式照射到標本的相鄰兩點上 之後被霧鏡收集並匯聚到DIC上棱鏡中 兩束分離的光又重新合併為一束 DIC棱鏡由兩塊光軸相互垂直的冰軸石構成 冰軸石具有雙折射特性 振動方向平行於光軸的光線折射率較高 當一束振動方向為45度的線偏振光 入射至第一塊光軸為0度的冰軸石時 會被分解為兩束能量箱等振動方向互相垂直的偏振光 進入第二塊光軸為90度的冰軸石時 對90度振動光線而言 相當於從低折射率介質進入高折射率介質 光線向髮線方向偏折 而對0度振動光線 則是從高折射率介質進入低折射率介質 光線向遠離髮線的方向偏折 最終 該棱鏡將一束入射光分離為兩束具有微小夾角的光線 這種結構稱為沃拉斯頓棱鏡 在實際光錄中 用於分光的沃拉斯頓棱鏡通常位於聚光鏡的前焦面 而荷光棱鏡則應位於物鏡的後焦面 然而 現代物鏡的光學結構往往非常複雜 後焦面常位於鏡組內部甚至透鏡之中 難以直接放置棱鏡 為此 通過對第一塊冰軸石的光軸方向加以調整 可使乾射面移至棱鏡外部 具備這一改進設計的棱鏡稱為諾瑪斯基棱鏡 諾瑪斯基棱鏡可安置在物鏡外部一定距離處 同時仍能有效使乾射平面位於物鏡後焦面位置 從而克服了沃拉斯頓棱鏡在使用中的限制 當光線通過棱鏡中心時 兩束光出射時相位相同 仍為線偏正光 被剪片器完全阻擋 因此中心區域最暗 若將棱鏡向右平移 光軸為0度的冰軸石部分厚度增加 使振動方向為0度的光束光程延長 出射時相對90度振動方向的光產生相位延遲 兩束光之間出現相位差 合成後變為橢圓或圓偏正光 無法被剪片器完全阻擋 亮度提高 向左平移時原理相同 僅光程差變化方向相反 最終在乾射平面中形成明暗相間的乾射條紋 由於白光由多種波長的複色光組成 不同波長的光對應的乾射條紋間距各不相同 重疊後即呈現為彩色條紋 因此通過平移其中一個DIC棱鏡 即可在背景中觀察到多彩的乾射圖案 當棱鏡沿特定方向平移一定距離後 參考光束的相位被適當延遲 此時背景區域呈現為棕灰色調 高折射率樣本呈左高右低的斜行分佈 穿過較後區域的採樣光束將發生額外相位延遲 導致其與參考光束之間的相位差減小 因而樣本區域成像比背景更暗 斜行斜率越大 採樣光束穿過的樣本厚度越大 相位延遲越顯著 成像也越暗 反之若樣本呈左低右高的斜行分佈 則參考光束穿過較後區域而產生相位延遲 致使兩束光之間的相位差增大 樣本成像比背景更亮 此時斜行斜率越大 相位延遲越明顯 亮度也越高 由此可見 DIC圖像中的明暗分佈與樣本光程差 在剪切方向上的一階導束具有明確的對應關係 以紅細胞為例 其直徑方向縱切面上的光程差分佈 呈中央凹陷邊緣凸起的圓盤狀 對該光程差曲線求一階導束 可得到其變化率曲線 為獲得最佳對比度 通常通過屏一上棱鏡預先引入一定的相位差 使背景調至棕灰色 此時 圖像中各像素點的明暗偏離背景的程度 取決於該位置光程差的變化率 及一階導束的絕對值大小 變化率越高 則明暗對比越強烈 變化率越低 則對比越弱 通過將光程差梯度映射為圖像中的亮度變化 最終即可得到紅細胞清晰的DIC圖像 DIC棱鏡的剪切距離 對圖像對比度具有重要影響 增大剪切距離 會使參考光束與採樣光束的空間間隔增加 從而更容易引入較大的光程差 產生更顯著的明暗對比 如圖所示 在一定範圍內 隨著光程差的增大 採樣光束與參考光束之間的相位差逐漸減小 導致成像趨暗 然而 當光程差超過某一域之後 採樣光束因過度延遲 反而會增大其與參考光束的相位差 使成像亮度上升 這一非線性響應 在實際成像中表現為明顯的邊緣增強效果 例如紅細胞暗邊緣外圍會出現明亮光韻 正是該效應的直觀體現 為緩解該問題 可通過減小DIC棱鏡的剪切距離來實現 參考光束與採樣光束的間距減小後 二者之間的光程差也隨之降低 儘管這會使圖像的整體對比度有所減弱 但能夠顯著減輕邊緣區域的明亮光韻現象 並顯著提升圖像的細膩程度 此類配置通常被稱為高分辨率DIC模式 在實際應用中常需配合視頻對比度增強技術 以在保持分辨率的同時獲得足夠的成像對比度 通過MATLAB仿真模擬不同剪切距離下DIC圖像 可以清晰觀察到剪切距離與成像對比度之間的密切關係 從而驗證上述成像機制 雖然DIC顯微鏡與相差顯微鏡 均藉助精密的光學元件 將樣本的光程信息轉換為圖像對比度 但二者的成像機制存在本質區別 簡而言之 相差顯微鏡是將樣本各點處的絕對光程差 直接線性的轉化為像平面中對應位置的明暗變化 而DIC顯微鏡則是將樣本在相鄰兩點之間的光程差變化率 及光程梯度或一階導數轉化為圖像中的明暗對比 從而形成具有定向陰影效果的浮雕狀圖像