【百年化學 美國篇】 【百年化學 美國篇 No.46】民科的諾獎之路，一個研究宇宙的生物化學家的幻想

如果要評選20世紀最不務正業的諾貝爾獎得主,凱利·穆利斯絕對能擠進前三甲。 這位老兄相信占星術,否認氣候變化,堅稱HIV和艾滋病沒關係,還公開宣稱自己的PCR靈感來自LSD。 但就是這麼一位科學界的名科,在1983年的某個深夜,開着車帶着熟睡的女朋友行駛在加州17號高速公路上時,腦子裏突然蹦出了一個念頭。 這個念頭最終讓他拿到了1993年的諾貝爾化學獎,順便把整個人類文明推進了一個新紀元,讓我們先把時間撥回到那個命運般的夜晚。 那是1983年的春天,穆利斯剛結束第三段婚姻,正處於人生的低谷期,他在美國最早的生物技術公司之一,賽特斯公司上班。 熱活說高級也高級,說枯燥也枯燥,大概就是分子生物學界的擰螺絲,重要但乏味。 公司當時接了個大項目,要分析連狀細胞貧血的突變,但遇到一個棘手的問題,DNA這玩意太嬌貴了,從細胞裏提取出來就像拆炸彈,稍有不慎就碎成渣。 哪怕從一千個完全相同的細胞裏提取,得到的也是一千段長短不一的DNA碎片,根本沒法用。 那天晚上,穆利斯和一位名叫珍妮芙的女同事,同時也是她的新戀人,約好去度假,她開着車,珍妮芙在副駕駛睡得正香,夜很黑,路很長。 太平洋海岸公路上的風從車窗灌進來,帶着鹹溼的海味,穆利斯的思緒開始飄,如果能把某一段特定的基因識別出來,然後複製它,再複製,再複製,像滾雪球一樣讓數量指數級增長,那豈不是想有多少DNA就有多少DNA? 就在這時,路邊的兩排路燈在她眼前幻化成DNA雙鏈,不斷離合,延伸,她想象着DNA雙螺旋像拉鍊一樣被拉開,然後用兩段影物像書籤一樣標記出想要的位置,再用DNA聚合酶像複印機一樣一頁一頁複製,等等。 如果每次複製完都要手動加一次酶,那這活不得把人累死?這個念頭像閃電一樣劈中了穆利斯,她後來回憶到,如果我能用兩個寡核肝酸而不是一個,分別在兩條互補鏈上,是不是就能從基因組裏特定的位置開始合成DNA了?這就是PCR的雛形,一個能讓DNA在室管裏自我複製的分子複印機。 她每隔幾分鐘就把車停在路邊,在紙巾,信封,甚至紙袋上瘋狂計算,如果第一輪複製得到兩份,第二輪四份,第三輪八份,三十輪之後就是十億份。這個數字讓她倒吸一口涼氣,她後來寫道,我當時意識到,如果這玩意能成,我就能讓DNA像細菌一樣指數級增長,而且只擴增我想要的那一段。 凌晨四點,他們終於到達度假小屋,慕麗絲把真妮服安頓好,自己卻像着了魔一樣,在每個能寫字的水平表面上畫小圖,桌子,椅子,牆壁,甚至浴室鏡子上都用口紅畫滿了DNA雙螺旋和箭頭。 在困惑與興奮交織的半清醒狀態中,迎來了黎明,但故事到這裏只講了一半。第二天回到公司,慕麗絲興沖沖地向老闆們彙報自己的天才想法,結果差點丟了飯碗。要知道,這位老兄在公司的形象實在不怎麼樣,他之前的工作經歷包括自由撰稿人和蛋糕店店員,平時吊兒郎當,還經常在實驗室裏搞些不務正業的研究。 最後,公司高層聽完他的彙報,面面相去,最後決定先把他降職轉崗,如果搞不出名堂就滾蛋。慕麗絲急了,連忙討價還價,我生物底子太爛,能不能派幾個技術員來幫我?公司領導冷笑,少來了,你不是生物化學博士,還發過Nature嗎? 慕麗絲,可我那篇Nature是關於宇宙學的。確實,這位奇葩博士曾在LSD的啓發下寫過一篇宇宙學論文,還發在了自然雜誌上,但在塞特斯公司,這反而成了他的黑歷史。 就在慕麗絲快要被掃地出門的時候,他的直屬上司湯姆·懷特站了出來,懷特是個有眼光的人,他覺得這個瘋瘋癲癲的想法可能真的有價值,於是拍板決定,讓慕麗絲繼續研究,同時指派亨利·厄爾利西帶領的人類遺傳學團隊與慕麗絲並行工作,目標是把PCR技術應用到連狀細胞貧血的診斷上。 厄爾利西團隊裏有個叫蘭迪薩基的技術員,後來成了PCR技術的實際操盤手,他們接到的第一個任務是,從一個110-基對的β株蛋白基因片段開始,看看能不能真的實現DNA擴增。慕麗絲負責畫大餅,寫專利,厄爾利西團隊負責把餅烙出來。 最初的實驗堪稱災難,他們用的是大腸桿菌DNA聚合酶,這玩意就像溫室裏的花朵,根本受不了95攝氏度的高溫。要知道,要讓DNA雙鏈分開,必須加熱到接近水的沸點,把兩條鏈之間的氫鍵打斷,就像拉開一條拉鍊,可普通的DNA聚合酶在這麼高的溫度下會直接熟掉,蛋白質變性,活性全失。 這意味着每完成一個循環,實驗人員都得手動添加新鮮的酶,繁瑣程度堪比古代超書匠,而且成本高昂,根本不具備實用價值。慕麗絲一度陷入了絕望,她後來回憶,那時候我就像個發明永動機的人,理論上可行,實際操作起來一團糟。 就在PCR技術快要胎死腹中的時候,命運給他們送來了第二個禮物,或者說是一個在黃石公園蘑菇泉裏泡了幾十億年溫泉的細菌。讓我們把時間倒回1966年的夏天,印第安納大學的微生物學家托馬斯·布洛克帶着他的本科生哈德森·弗里茲來到黃石國家公園,當時的科學界普遍認爲生命無法在55攝氏度以上的環境中存活,那簡直是生命的禁區,蛋白質會變性。 細胞膜會融化,DNA會斷裂,但布洛克是個不信邪的主,他在蘑菇泉的滾燙池水裏發現了生命,而且是活得相當滋潤的生命。弗里茲那年剛讀完大二,是個充滿好奇心的年輕人,爲了這次研究,他在黃石公園邊緣的小木屋裏住了一個夏天,每天躲着熊,還有熊造成的交通堵塞,跑到溫泉邊採樣。 1966年9月19日,他從蘑菇泉的黃色藻類墊中採集了一份樣品,溫度大約69攝氏度。回到實驗室後,弗里茲在培養品裏看到了讓他終生難忘的一幕,在接近沸騰的培養基裏,細菌正在歡快地分裂,生長我看到的是前所未有的東西。 多年後,弗里茲回憶道,我現在想起那個顯微鏡下的畫面,仍然會起雞皮疙瘩。1969年,布洛克和弗里茲在《細菌學》雜誌上正式發表了這一發現,將這種細菌命名爲水生氣熱菌,意思是溫水域居住者,雖然他生活的環境對大多數人來說已經是開水了,更重要的是,他們把菌株保存在了美國典型培養物保藏中心,一個對全世界科學家開放的非盈利性衛生物庫。 布洛克後來寫道,我們當時只是想要一個簡單系統來研究微生物生態學,沒想到會引出這麼多東西。1970年,布洛克團隊從TAQ中分離出了一種能在95攝氏度高溫下正常工作的酶。 1976年,新興大提大學的團隊進一步純化出了TAQDNA聚合酶,但直到1983年,當穆利斯和厄爾利西團隊被PCR的加酶難題折磨得死去活來的時候,這個在黃石公園溫泉裏泡了幾十億年的細菌,才終於等到了它的高光時刻。 塞特斯公司的技術人員弗雷德·福爾克,綽號福卡,是第一個把TAQ聚合酶應用到PCR中的人。1986年,當厄爾利西團隊發表那篇使用TAQ聚合酶的里程碑論文時,整個分子生物學界都震驚了,這種酶簡直就是爲PCR量身定做的。 它能在95攝氏度的開水裏保持活性,在72攝氏度時工作效率最高,就像個不知疲倦的分子工人,無論室管裏怎麼冰火兩重天,它都能穩定輸出。有了TAQ聚合酶,PCR終於從手工小作坊升級爲自動化流水線。 1985年,穆利斯·薩基和厄爾利西發表了那篇著名的論文,正式向世界展示了PCR技術。1988年,第一臺自動化PCR熱循環一問世,由珀金·埃爾默和塞特斯公司聯合推出。1989年,TAQ聚合酶被科學雜誌評爲首個年度分子,這是該雜誌歷史上第一次評選年度分子,排面拉滿。 現在讓我們深入PCR的核心原理,看看這個分子複印機到底是怎麼工作的。想象一下,你手裏有一本珍貴的古籍,但只剩下一本,字跡還模糊不清,你想複製出11本一模一樣的,怎麼辦?PCR給出的解決方案堪稱天才,利用DNA的半保留複製特性,通過精確的溫度控制,讓DNA自己克隆自己。 整個過程就像一場精心編排的三幕劇,在熱循環儀這個小舞臺上循環上演,第一幕叫變性,溫度飆升到94到98攝氏度,持續20到30秒,這時候DNA雙鏈之間的氫鍵被打斷,像被撕開的拉鍊一樣分成兩條單鏈,這個溫度足以讓大多數蛋白質變性,但TAQ聚合酶只是打了個哈欠,表示就這。 這裏有個絕妙的科學細節,DNA雙鏈的穩定性來自鹼基之間的氫鍵,線票令和胸線密定之間形成兩個氫鍵,鳥票令和包密定之間形成三個氫鍵,所以GC含量高的DNA片段需要更高的溫度才能變性,這就是爲什麼設計PCR程序時要考慮目標序列的GC含量。 第二幕是退火,溫度驟降到50-65攝氏度,這時候,事先加入的兩條引物像兩個精準的分子磁鐵,找到自己的互補序列並貼上去,引物的設計是PCR成功的關鍵。 如果溫度太高,引物貼不上去,溫度太低,引物會亂貼儀器,複製出亂七八糟的東西,通常退火溫度比引物的溶解溫度低3-5攝氏度,這是個需要反覆調試的參數。 這裏面的門道可多了,引物長度一般在18-15個剪輯之間,太短了特異性不夠,可能貼到基因組的其他地方,太長了退火溫度太高,TAQ酶可能受不了。 引物三撇端的最後幾個剪輯尤其關鍵,如果這裏和模板不匹配,聚合酶就會拒絕開工。 此外,兩條引物的退火溫度要相近,否則一個已經貼上了,另一個還在到處遊蕩,效率就會大打折扣。 第三幕是延伸,溫度調到72攝氏度,這是TAQ聚合酶的最適工作溫度,酶沿着模板鏈滑動,抓住遊離的DNTP,按照剪輯互補配對原則,一條嶄新的DNA鏈就合成出來了。 這個過程的方向是5撇到3撇,就像工廠的生產線,只能朝一個方向運轉。 TAQ聚合酶的工作效率大約是每分鐘添加1000個核苷酸,所以對於1000剪輯隊以內的片段,延伸30秒到1分鐘就夠了。 但如果目標片段很長,比如超過5000剪輯隊,就得給酶更多時間,或者換用專門的長片段聚合酶。 一個循環下來,一條雙鏈DNA變成了兩條,30個循環之後,理論上你能得到2的30次方,也就是10億73741824份拷貝,超過10億份。 當然,現實中由於設計消耗、沒活性下降、影霧耗盡等因素,後期效率會降低,進入所謂的平臺期。 但即便如此,從一根頭髮絲裏的微量DNA擴增到足以進行各種分析的量,已經完全不在話下。 這裏有個絕妙的比喻,PCR就像是在玩傳話遊戲,但規則是每一輪每個參與者都要把聽到的話同時傳給兩個人。 第一輪一個人,第二輪兩個人,第三輪四個人,到了第三十輪,全世界的人都不夠用了。 而TAQ聚合酶就是那個不知疲倦的傳話源,無論環境多惡劣,它都能保持清醒,確保信息準確傳遞。 當然,TAQ也不是完美的,它缺乏三撇到五撇外切酶活性,也就是說,它沒有校對功能,複製時出錯的概率大約是每十萬個剪輯隊中有一個錯誤。 對於一般應用來說,這夠用了,但如果需要高精度,科學家們會選用PFU聚合酶,或者把少量PFU和TAQ混合使用,許長補短。 PCR技術的革命性影響,怎麼誇張都不爲過,在刑偵領域,它徹底改變了鐵證如山的定義。 1994年,辛普森殺妻案震驚全美,檢方在犯罪現場發現了幾滴血跡,通過PCR檢測,確認這些血跡與辛普森的血液在遺傳上完全匹配,匹配概率高達1.7億分之一。 雖然辯方以樣本可能被污染爲由質疑PCR的可靠性,但PCR在法醫學中的地位已經不可撼動,從一根頭髮,一滴精液,一片指甲,甚至幾十年前的骨骼樣本中,PCR都能提取出足夠的DNA信息進行比對。 在醫學診斷領域,PCR簡直是病原體的照妖鏡,以前要檢測結核桿菌,得等好幾個星期培養細菌,現在用PCR,幾小時就能從患者的痰液中檢測出結核桿菌的DNA,還能順便檢測它是否對利弗平耐藥,GHIV檢測更是如此。 傳統的抗體檢測要等感染後幾周才能檢出,而PCR可以直接檢測病毒RNA,在感染早期就能發現,爲治療贏得寶貴時間。 2020年新冠疫情爆發,全球每天進行的數百萬次核酸檢測,核心就是RTPCR技術,從鼻咽拭子裏抓取病毒的RNA片段,逆轉錄成DNA,然後瘋狂複製,直到儀器能檢測到熒光信號。 在分子生物學研究中,PCR更是基礎設施級別的存在,人類基因組計劃,沒有PCR,測序速度得慢幾個數量級,基因工程,PCR是克隆基因的標準起手式。 古DNA研究,從4萬年前的蒙馬象骨骼,埃及木乃伊的組織,甚至尼安德特人的化石中提取DNA,全靠PCR的放大能力。 1993年,穆利斯和麥克爾史密斯一起站上了諾貝爾化學獎的領獎臺,值得一提的是,布洛克和弗里茲,那個在皇室公園發現TAQ的師生組合,從未因此獲得任何經濟利益,他們慷慨地將均珠捐贈給ATCC。 2013年,布洛克和弗里茲獲得了金額獎,這個獎項專門表彰那些最初看起來毫無用處的基礎研究,最終卻產生了巨大社會影響的工作。 他晚年創建的自然保護區成了他留給世界的另一份禮物,而弗里茲後來成爲了聖地亞哥桑福德伯納姆普雷比斯醫學研究所的主任,繼續着他的科研生涯。 有趣的是,蘑菇泉後來成了微生物學界的聖地。 黃石公園的地質學家麥克爾·波蘭經常收到請求,要帶微生物學學生去蘑菇泉朝聖,他們想去那個地方致敬。 波蘭說,雖然從科學上講,TAQ在其他溫泉裏也能找到,但蘑菇泉在他們心中有着特殊的地位。 弗里茲本人也去過一次回訪,當一位不知情的遊客問他是否知道那個著名細菌的來源時,弗里茲指着蘑菇泉的方向說,就在那邊。 微笑着說出了那句經典臺詞,相當確定PCR的故事還遠未結束。 從最初的基本款,科學家們已經發展出了各種DLC擴展包,實時熒光定量PCR能在擴增的同時實時監測產物量,精確到單分子級別,逆轉路PCR能處理RNA,讓基因表達分析成爲可能。 數字PCR把樣品稀釋到單分子水平,實現絕對定量。 還有熱啓動PCR,潮式PCR,多重PCR,每一種變體都是爲了解決特定問題而生。 弗里茲本人在1993年的諾貝爾獲獎演說中,用他特有的方式總結了這段經歷。 從單個DNA分子開始,PCR可以在一個下午產生1000億個相似的分子,這個反應很容易執行,只需要一個室管,幾種簡單的試劑和一個熱源。 而正是這個簡單的反應,讓我們得以窺探生命的密碼,追蹤疾病的蹤跡,伸張遲來的正義。 在這個意義上,PCR不僅是一項技術,它是人類理解自身,理解生命的橋樑,一座由一條高速公路,一個溫泉軍和無數科學家的好奇心共同搭建的橋樑。 下次當你看到核酸檢測報告,看到新聞裏通過DNA鎖定真兇的報道,或者聽說某個遺傳病被早期診斷時,不妨想想那個在加州高速公路上開車的夜晚。 科學的奇蹟有時候就誕生在最平凡的瞬間,誕生於一個瘋子的幻覺,一個學生的堅持和一個細菌的頑強生命力交織的地方。